Доктор Матиас Лихтерфельд, член исследовательской группы, прокомментировал в журнале Science, что результаты исследования повышают вероятность «мирного сосуществования между ВИЧ и людьми».
Предыстория — резервуары и контроллеры
При ВИЧ-инфекции патоген не просто разрушает клетки, превращая их в фабрики для своих копий, как это делает большинство вирусов. Будучи ретровирусом, он способен встраивать свои гены в человеческую ДНК в ядрах наших клеток, тем самым становясь их частью. Некоторые из этих клеток относятся к Т-клеткам памяти, чья работа состоит в том, чтобы хранить информацию о перенесенных инфекциях, или о том, что выглядит как перенесенная инфекция, то есть о вакцинах.
У людей, которые получают эффективную антиретровирусную терапию, некоторые из этих клеток содержат скрытые «инструкции» для создания новых вирионов ВИЧ, невидимые для иммунной системы. Это действительно спящие клетки, содержащие так называемый резервуар ВИЧ.
При прерывании АРТ у большинства людей эти клетки-резервуары снова начинают производить вирусы. Но у кого-то — нет. Почему?
Некоторые люди — примерно один из 200 пациентов с ВИЧ — являются так называемыми элитными контроллерами, у которых вирусная нагрузка остается неопределяемой даже без антиретровирусной терапии.
У двух человек — калифорнийки по имени Лорин Вилленберг и пациентки Эсперансы, названной в честь ее родного аргентинского города, — этот процесс, кажется, достиг своей конечной точки: обе, по-видимому, вылечились от ВИЧ без медицинского вмешательства.
Еще больше людей являются так называемыми контроллерами после лечения. Это пациенты с прогрессирующей ВИЧ-инфекцией и определяемой вирусной нагрузкой, которые начинают АРТ, но затем по какой-то причине прекращают прием лекарств и сохраняют неопределяемую нагрузку в течение месяцев или лет после этого.
Потенциальных контроллеров после лечения может быть намного больше, чем мы знаем, потому что большинство людей, получающих длительную АРТ, очень редко ее прекращают. Первоначальное французское исследование, посвященное их изучению, показало, что их может быть до одного из 14 человек, получающих АРТ. Известно о другой аргентинской женщине, которая сообщила в прошлом году, что у нее изначально была тяжелая форма ВИЧ и она принимала АРТ в течение десяти лет. Она прекратила ее из-за побочных эффектов, а спустя 12 лет у нее были минимальные признаки ВИЧ, и ей не пришлось возобновлять терапию.
Исследование 2020 года выявило основную причину вирусного контроля, наблюдаемого у таких пациентов, и тем самым определило еще один потенциальный путь к излечению.
Ученые искали последовательности генов ВИЧ, скрытые в ДНК внутри иммунных клеток 64 элитных контроллеров. Как и ожидалось, у них было обнаружено меньше отрезков провирусной ДНК, чем у других людей с ВИЧ. Но одновременно они установили более высокую пропорцию неповрежденной ДНК, способной давать начало новым вирусам.
Но решающим было то, где именно находилась эта ДНК. Оказалось, что она локализована в так называемых генных пустынях — частях генома, состоящих из «мусорной», или структурной ДНК, и не являющихся активными генами. Эту ДНК почти невозможно «разбудить».
Исследователи предположили, что у элитных контроллеров в течение многих лет на АРТ иммунная система опознавала тонкие внутриклеточные признаки репликации вируса — прежде всего, фрагменты вирусной РНК, которые «считываются» с ДНК и отправляют сигнал клеточным механизмам создавать новые вирусы. Таким образом, клетки, содержащие наиболее транскрипционно активную провирусную ДНК, избирательно уничтожаются клетками CD8 иммунной системы, оставляя только клетки с постоянно «закрытым и заблокированным» вирусом.
Новое исследование
Исследовательскую группу возглавляют доктора Сюй Юй и Матиас Лихтерфельд из Института Рагона. Это перспективное сотрудничество между Гарвардским университетом, Массачусетским технологическим институтом и общеклинической больницей штата Массачусетс. Их команда в настоящее время связывается с людьми, которые более 20 лет стабильно получают антиретровирусную терапию, чтобы выяснить, удалось ли им тоже «сослать» свой вирус в «генетическую Сибирь».
В новом исследовании сообщается о шести таких пациентах, которые длительное время находятся на АРТ. Команда Рагона использовала современные технологии для проведения глубокого генетического исследования ДНК ВИЧ, скрытой в иммунных клетках Т-лимфоцитов этих шести добровольцев.
Участникам исследования от 54 до 74 лет. Одна пациентка — женщина, у одного из них не указан пол, остальные — мужчины. Все они получали АРТ не менее девяти лет на дату взятия последнего образца клеток. Они были выбраны потому, что еще в 2001 году у них были взяты анализы, подходящие для глубокого секвенирования. У троих образцы были взяты до начала АРТ или в одном случае — во время перерыва. У четырех — через год после начала АРТ, и у всех шести образец был взят между 9 и 15 годами после начала АРТ, у троих — совсем недавно.
Сложный анализ «Параллельная РНК, интеграция и провирусное секвенирование» (PRIP-seq), который использовали ученые, исследует миллионы свободно плавающих клеток лимфоцитов в крови пациентов (PBMC), разбавленные до нескольких тысяч в каждом образце. Поскольку в клеточном резервуаре от одной из десяти тысяч до одной из миллиона клеток или даже меньше содержат ДНК ВИЧ, исследователи смогли обнаружить отдельные последовательности ДНК ВИЧ в конкретных клетках.
Им удалось найти обособленные отрезки ДНК ВИЧ в 1270 клетках. Большинство этих провирусов на самом деле были дефектными и неспособными дать начало целым вирусам. Ученые обнаружили 147 отрезков полного, неповрежденного генома ВИЧ у шести пациентов — чрезвычайно мало по сравнению с миллионами отобранных клеток.
Также было обнаружено 429 клеток, которые одномоментно или в течение определенного времени активно производили измеримые количества РНК ВИЧ и, следовательно, активно транскрибировали «инструкции» ВИЧ независимо от того, были ли эти «инструкции» полными. В некоторых случаях, если их РНК-инструкции были «урезаны», вирусы могли воспроизводиться повторно.
Метод PRIP-seq не просто искал вирусную ДНК. Он также мог точно определить, где в геноме человека встроен каждый отрезок ВИЧ — и, следовательно, находится ли он рядом с активным участком, где гены хозяина часто «бодрствуют» и производят свои собственные РНК-сообщения, или же он застрял в «генной пустыне».
Ученые обнаружили, что ВИЧ может интегрироваться практически в любое место генома. Они выявили провирусы в каждой из 23 пар хромосом у всех пациентов — в активных и закрытых участках. Важно было не только то, где ДНК ВИЧ располагалась линейно в ДНК человека. Важна была и близость к активным генам соседних хромосом, потому что человеческая ДНК содержит около трех миллиардов отдельных оснований («букв») в своей цепи и должна быть свернута сложным образом. Таким образом, функциональная близость может быть не только внутри каждой хромосомы, но и между ними.
Исследователи обнаружили 701 клетку, где в первоначальных образцах было возможно определить точный участок интеграции, и установили, что в 117 клетках провирусная ДНК находилась в области, не содержащей функциональных генов. Даже в них вирусная РНК обнаруживалась примерно в 22 клетках, однако маловероятно, что она была функциональной.
Важнейшим фактором, определяющим, что ВИЧ-инфицированная клетка вырабатывает РНК ВИЧ, является то, что ДНК ВИЧ находится рядом с активным человеческим геном или областью человеческой ДНК, которая включала активные гены. И наоборот, второй по значимости детерминантой производства РНК было нахождение рядом с областью, которая была заблокирована в неактивной форме (процессом, называемым метилированием), или рядом с областью человеческой ДНК, которая это вызвала.
Но самым сильным предиктором того, что клетки не продуцируют РНК ВИЧ, был период времени, в течение которого участники исследования находились на АРТ, что подтверждает гипотезу исследователей о том, что функциональная ДНК ВИЧ, способная к транскрипции, со временем встречается все реже.
Только у трех пациентов, у которых в разное время были взяты несколько образцов РВМС, можно было измерить последовательное разрушение провирусной ДНК. Доля клеток, продуцирующих жизнеспособную РНК ВИЧ, упала в пять раз у двух пациентов, у которых образцы клеток были взяты через 9 лет после первого анализа, и практически до нуля у одного добровольца, у которого образцы были взяты 12 лет спустя. У четвертого пациента был взят только один образец клеток через 15 лет после начала АРТ, и у него также не было признаков вирусной РНК.
Таким образом, на индивидуальном уровне были обнаружены доказательства «блокировки» вирусной ДНК у четырех из шести пациентов. Считается, что этот процесс происходит потому, что даже при АРТ иммунная система может обнаруживать очень низкие уровни РНК ВИЧ, которые продуцируют клетки, и выборочно убивать наиболее активные, поэтому остаются только клетки с заблокированной вирусной ДНК.
Ученые отмечают, что стратегии лечения kick & kill («ударь и убей»), которые полагались на активацию всего клеточного резервуара, дали в значительной степени разочаровывающие результаты, потому что все, что они сделали, это подсчитали, вызвали ли они общее сокращение Т-клеток памяти, содержащих вирусную ДНК, чего в реальности не произошло.
При этом, если активация выборочно отбраковывает клетки, которые производят больше всего РНК, — тогда такие стратегии могут привести к созданию резервуара клеток, которые все еще содержат ДНК ВИЧ, но не могут начать производить вирусные компоненты. Даже когда клетки четырех пациентов стимулировали в лабораторной чашке мощными генными активаторами, они не продуцировали никакой РНК ВИЧ.
В результате остались только два пациента, у которых история была несколько иной, без снижения уровня вырабатываемой вирусной РНК.
Было обнаружено, что в одном случае длинный фрагмент провирусной ДНК был вставлен в середину человеческого гена под названием KDM2A. Это онкоген, работа которого обычно заключается в стимуляции клеточного деления, но который, если его «заклинит», может вызвать рак. В другом — вирусная ДНК не находилась внутри генов, но локализовалась возле отрезка ДНК, который являлся мощным разрушителем хромосомной архитектуры, заставляя ДНК принимать более открытую конфигурацию, допускающую генетическую активацию. У этого добровольца сохранялась низкая, но определяемая вирусная нагрузка порядка 20 копий/мл на протяжении всего времени приема АРТ.
Возник вопрос: почему то же самое иммунное давление не уничтожило эти постоянно активные участки вирусной ДНК?
Вероятный ответ заключается в том, что ВИЧ-инфекции не нужно поддерживать себя за счет активации, транскрибирования РНК и производства вирусных компонентов. Она может делать это и без производства РНК, если они находятся в иммунной клетке, которая делится и при этом просто копирует свою ДНК, включая провирусную.
Поскольку такая так называемая клональная экспансия не тревожит иммунную систему, селективная отбраковка активных клеток-резервуаров невозможна, и если ДНК ВИЧ окажется в часто активируемой части генома человека, она там и останется.
Это означает, что, как и в других аспектах ВИЧ-инфекции, существует эволюционная «гонка вооружений» между способностью иммунной системы удалять продуктивно зараженные ВИЧ клетки и способностью тех же клеток копировать себя перед элиминацией.
Поиск генетической сигнатуры, которая укажет, являетесь ли вы контролером после лечения или вы рискуете при прекращении АРТ, требует сложных инструментов для секвенирования генов, как в этом исследовании. Именно поэтому оно еще не готово для клинического применения.
Следующим шагом для команды из Института Рагона, однако, является скрининг пациентов, получающих длительную АРТ, на наличие признаков того, что вся их провирусная ДНК ВИЧ расположена в непродуктивных областях, а затем снятие части АРТ под тщательным медицинским наблюдением, чтобы АРТ можно было возобновить при первых признаках реактивации вируса.
В сообщении журнала Science указано, что один доброволец уже согласился присоединиться к описанной выше стратегии, а Сюй Юй и Лихтерфельд проверяют остальных возможных участников.
