Эпидемия

Тайна двух полосок. Как работают тесты на ВИЧ?

После выхода известного фильма Дудя большинство ВИЧ-сервисных НКО захлестнула волна желающих провериться. В том числе и СПИД.ЦЕНТР — поток клиентов увеличился почти втрое, а на тестирование пришли люди, раньше никогда не посещавшие открытого пространства фонда на Artplay.

Впрочем, и сам Дудь в помещении нашего фонда протестировался, эти кадры есть в фильме. Белой лопаточкой с пластиковой ручкой он проводит по деснам, затем предъявляет результат — одна полоска. «Здоров!»

Ввиду большого интереса публики, в том числе и клиентов, дошедших до нашего лофта на Нижней Сыромятнической, сегодня мы рассказываем, как устроены эти и другие тесты на ВИЧ. Почему на ручке тестера появляются полоски, насколько такое тестирование достоверно и надежно, а главное — какие альтернативы ему существуют.

Все, что вы хотели узнать о технологии тестирования на ВИЧ-инфекцию, — в одном материале.

Коротко о вирусе ВИЧ и ИФА

Все анализы на ВИЧ предназначены для того, чтобы либо разыскать части вируса, либо зафиксировать реакцию организма на его присутствие. Поэтому, чтобы понять, как работают тесты на ВИЧ, нужно примерно представлять, как устроен вирус и как он себя ведет, оказавшись в клетке.

Вирус ВИЧ — член семейства ретровирусов (Retroviridae). Представители этого семейства выглядят как крохотные круглые частицы, у которых есть оболочка, усеянная особыми белками. При помощи этих белков вирус распознает клетку-жертву и прикрепляется к ней.

Затем оболочки клетки и вируса сливаются, а внутрь клетки попадает содержимое вируса — нуклеокапсид. Нуклеокапсид — это белковая капсула, внутри которой находятся генетическая информация об устройстве вируса — две копии двухцепочечной РНК — и набор ферментов, которые «включают» РНК, когда та окажется в клетке. После слияния вируса с клеткой нуклеокапсид открывается, РНК и вирусные ферменты попадают внутрь, а сам вирус начинает свое черное дело.

Вирион ВИЧ. Реконструкция. Красным показаны белки, с помощью которых вирус присоединяется к клетке.

Тестов на ВИЧ очень много, но их можно разделить на несколько больших типов. Те экспресс-тесты, которыми пользуются большинство ВИЧ-сервисных НКО, устроены по принципу иммуноферментного анализа, или ИФА.

Их задача — определить антитела к ВИЧ, которые организм вырабатывает в ответ на проникновение в него вируса.

Как это работает? Когда вирус ВИЧ попадает в организм, иммунная система человека не сидит без дела. Она начинает продуцировать антитела — иммунные белки, которые помогают организму бороться с инфекцией. Эти белки можно обнаружить во многих биологических жидкостях.

Способов обнаружения таких антител существует много. Но наиболее популярным считается именно иммуноферментный анализ (ИФА). За рубежом этот тест называется enzyme-linked immunosorbent assay, сокращенно — ELISA.

Почему две полоски?

Принцип ИФА основан на реакции «антиген-антитело». У человека берут кровь или жидкость с десен (это не совсем слюна), в которой могут находиться антитела к вирусу ВИЧ.

Затем к ней добавляют реактив с белками вируса ВИЧ, а вернее, антигенами, но не простыми, а «доработанными». Антиген, который используют в реакции, отличается от обычного вирусного белка тем, что к нему «прицепили» химическую метку.

Пока «меченые» антигены плавают в реактиве сами по себе, ничего не происходит. Но если в биологической жидкости есть антитела к ВИЧ, то они соединятся с «мечеными» антигенами и дадут сигнал, который может засечь лаборант или экспресс-тест. Если антител к ВИЧ нет — сигнала не будет.

Напомним: антитела — это частицы, которые организм вырабатывает в ответ на присутствие в нем вируса. Антигены — частицы самого вируса. В данном случае модифицированные.

В экспресс-тестах, которые используются фондом СПИД.ЦЕНТР и многими другими нашими коллегами для бесплатного и анонимного тестирования, антитела тонкой линией нанесены на специальную поверхность, спрятанную под пластмассовым корпусом тестера.

Сначала клиент промокает десневую жидкость лопаточкой, установленной на конце тестера. А как только жидкость собрана, лаборант опускает лопаточку в реагент, который в течение 15 минут поднимается по тестеру, достигая в итоге полоски с антигенами.

Если антитела в десневой жидкости, смешанной с реагентом, были — полоска краснеет.

Как правило, на ручке тестера имеется и вторая полоса — контрольная, она окрашивается в красный всегда. Так что, как правило, отрицательный результат (вируса в организме нет) маркируется одной полоской на рукоятке тестера, а положительный (вирус в организме есть) — двумя.

Экспресс-тестеры на ВИЧ. Слева положительный (две полоски), справа отрицательный (одна) результат.

Две полоски на тестере — это верный признак того, что человек некоторое время назад получил ВИЧ-инфекцию. А стало быть, клиенту срочно нужно обратиться к врачу за терапией — в областной или городской центр СПИД. Там ему будут назначены подтверждающие анализы и прописана антиретровирусная терапия.

Точно такой же тест (ИФА), только лабораторный, можно сделать и во многих коммерческих клиниках — но за деньги. Технология его в целом выглядит так же, а точность отличается незначительно.

Какие бывают тесты ИФА?

●        «Домашний» экспресс-тест — OraQuick HIV ½ Rapid Antibody Test. Материал для теста — жидкость, которую собирают с десен специальной мягкой щеточкой. Тест выдает результат очень быстро: в течение 20 минут.

●        Лабораторный ИФА-тест — анализ на ВИЧ по форме 50. В нашей стране его применяют в качестве стандартной процедуры лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Материал для анализа — кровь из вены, которую нужно сдавать в лаборатории. Результаты приходят через 1—5 дней.

Что важно знать об ИФА-тестах?

У всех ИФА-тестов есть два серьезных недостатка. Во-первых, ИФА-тесты не определяют вирус ВИЧ сразу после инфицирования. Так происходит, потому что антитела к вирусу ВИЧ вырабатываются не сразу. Современные ИФА-тесты позволяют «засечь» иммунные белки только через 23—90 дней после заражения. Если сдать анализ до этого срока, можно попасть в «серологическое окно» — так называется время, в течение которого иммунная система еще не успела создать антитела к вирусным белкам, хотя вирус в организме уже есть.

Во-вторых, ИФА-тесты на ВИЧ иногда дают ложноположительные результаты — то есть «находят» вирус ВИЧ у людей, у которых его на самом деле нет. Лабораторный ИФА-тест на ВИЧ может ошибаться так же, как и экспресс. Именно поэтому все положительные ИФА-тесты, как правило, подлежат проверке при помощи более надежных методов. В нашей стране с этой целью применяют вестерн-блоттинг.

Подтверждающие тесты: вестерн-блоттинг (WB)

Цель этого теста — подтвердить результаты первичного анализа.

Вестерн-блоттинг можно провести только в лаборатории. Такие тесты не бывают «карманными», именно поэтому все НКО, которые тестируют граждан на ВИЧ, в итоге отправляют своих клиентов в лаборатории центров СПИД сдавать именно этот анализ, если экспресс-тестер показал положительный результат.

Вестерн-блоттинг (или иммуноблот) по технологии — тот же ИФА-анализ, основанный на реакции «антиген-антитело», только очень точный, долгий и кропотливый.

Строение вируса ВИЧ. Схема.

Чтобы провести анализ, у человека берут кровь и добывают из нее сыворотку. Это все та же кровь, только без эритроцитов, иммунных клеток и всего остального, что может образовывать сгустки крови. Потом эту сыворотку наносят на полоску из нитроцеллюлозы, на которой в строгом порядке размещены различные антигены ВИЧ — белки из оболочки и нуклеокапсида вируса. Если в сыворотке крови уже успели появиться антитела, они свяжутся с антигенами, размещенными на полоске.

Потом к смеси добавляют новый реактив-«проявитель». Как и в фотографии, этот реактив нужен, чтобы понять, прошла реакция или нет. В реактиве-«проявителе» находятся антитела, помеченные химической меткой. Но это антитела не к антигенам вируса ВИЧ, а к человеческим антителам, которые умеют связываться с комплексом «антиген-антитело».

Если в образце есть комплекс «антиген-антитело», на полоске проявятся окрашенные полосы. Каждая полоска означает свой вирусный белок. Реакция считается очень точной — в большинстве случаев вестерн-блоттинг позволяет исключить случайное срабатывание теста.

Какие бывают тесты этого типа? Разные. Некоторые позволяют подтвердить наличие вируса ВИЧ-1, некоторые — ВИЧ-2, а некоторые — обоих вариантов вируса сразу.

Пример: российская тест-система ИФА-Лайн-Блот-ВИЧ-1,2. Эта тест-система участвует в тендерах — закупках в государственные лаборатории, которые действуют при СПИД-центрах.

Что важно знать о вестерн-блоте?

В России вестерн-блоттинг считается золотым стандартом подтверждения ВИЧ-инфекции. Проблема заключается в следующем.

1.      Вестерн-блоттинг все равно иногда дает неопределенный результат. В этой ситуации тест придется пересдать, причем только через три недели.

2.      Вестерн-блоттинг дорогой и долгий. Тест требует сложного оборудования, кропотливой работы и квалифицированного персонала. А чтобы разобраться с результатами, нужна помощь эксперта.

В чем проблема с российскими анализами на ВИЧ?

В нашей стране для подтверждения ВИЧ-статуса используют лабораторный ИФА-тест и вестерн-блоттинг — это стандартная процедура. Однако Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) отмечает: в странах, где действует эта схема, на определение ВИЧ-статуса тратится очень много времени и средств. Причем ожидание результата настолько изматывает, что некоторые пациенты даже жалеют о решении узнать свой ВИЧ-статус.

Эксперты ВОЗ советуют отказаться от лабораторных ИФА-тестов и вестерн-блоттинга в пользу комбинированных экспресс-тестов, которые дают быстрый и более надежный результат. И это действительно работает.

Например, в США от «подтверждающего» инфекцию вестерн-блоттинга в принципе отказались. И для определения, и для подтверждения ВИЧ-статуса в этой стране используют комбинированные лабораторные и экспресс-тесты. Это не только дешевле для государства, но и психологически проще для людей: поскольку время ожидания меньше, а сама процедура — проще, все больше американцев вовремя узнают свой ВИЧ-статус и начинают своевременное лечение.

Комбинированные тесты

Цель комбинированных тестов, как и вестерн-блоттинга, — определить ВИЧ-статус человека.

Они представляют собой тот же анализ ИФА, но усовершенствованный — «два в одном». Тест позволяет определить не только человеческие антитела к вирусу ВИЧ, но и вирусный антиген — белок p24. Из этого белка состоит внутренняя оболочка вируса — нуклеокапсид, о котором мы говорили выше.

Комбинированные тесты на ВИЧ тоже бывают «домашними» и лабораторными.

●        Пример «домашнего» комбинированного экспресс-теста — анализ Alere HIV Combo. Этот анализ можно сделать по крови из пальца (по сыворотке тоже, но годится и «простая» кровь), а результаты известны уже через 20 минут.

●        Пример лабораторного комбинированного теста — HIV Ag/Ab Combo, который делают в частных лабораториях за деньги.

Что важно знать об этом тесте? Этот анализ относится к четвертому поколению. На сегодняшний день во всем мире именно он считается оптимальным способом выявления инфекции, потому что недорог и позволяет относительно рано узнать ВИЧ-статус клиента.

Если речь идет об определении ВИЧ-статуса, то в Европе и США чаще всего прибегают именно к комбинированным тестам. Если тест дает положительный результат, нет необходимости проводить подтверждающий анализ, его просто через некоторое время сдают повторно — и это считается достаточно надежным.

Дело в том, что антиген — вирусный белок р24 — появляется в крови уже в первую неделю после заражения, то есть задолго до того, как вырабатываются антитела. Поскольку комбинированный тест определяет антиген, шанс узнать свой статус есть уже через 21—28 дней после предполагаемого инфицирования.

После того как начинают вырабатываться антитела, вирусный белок р24 из крови пропадает. Иногда это происходит уже на вторую неделю, но у 90—95 % инфицированных людей антитела появляются в крови в первые три месяца после заражения.

Предсказать, когда именно появятся антитела, невозможно, ведь организм каждого человека по-своему реагирует на вирус ВИЧ. Но даже если антиген р24 из крови успеет исчезнуть, комбинированный тест найдет если не р24, то как минимум антитела, и все равно даст верный ответ.

ПЦР: самый сложный анализ

Тесты, позволяющие определить непосредственно генетический материал вируса ВИЧ, называются полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ).

Методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), при помощи которой можно определять вирус ВИЧ, существует много. Но понять, что именно происходит в пробирке, проще всего на примере ПЦР с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ).

Этот тест позволяет обнаружить РНК вируса ВИЧ в крови. Если немного упростить, то реакция выглядит следующим образом. Сначала в сыворотку, содержащую РНК вируса, добавляют фермент, который «собирает» вирусную ДНК, используя РНК в качестве матрицы, — то есть проделывает почти то же самое, что и вирус, попавший в клетку.

Затем проводят стандартную ПЦР — реакцию, позволяющую увеличить концентрацию ДНК в образце до величин, которые уже можно без труда зафиксировать. Для этого к получившейся ДНК добавляют нуклеотиды — «кирпичики», из которых строится ДНК, — и фермент, который собирает из этих нуклеотидов вторую ДНК-цепочку. Чтобы фермент сработал, все это нагревают до определенной температуры и повторяют множество раз — до тех пор, пока не наберется достаточно ДНК. В таком виде тест можно использовать для определения ВИЧ-статуса человека.

Реакцию ПЦР-ОТ можно провести в режиме реального времени. Это помогает достаточно точно понять, сколько вирусных частиц находится в организме. Обычно для этого в реакционную смесь добавляют кусочек ДНК, помеченный химическим веществом, которое начинает светиться, когда кусок ДНК встраивается в молекулу. Так как этот кусочек ДНК подходит только к одному участку вирусной ДНК, можно подсчитать количество вспышек и понять, сколько же вирусной РНК первоначально было в образце.

Видео: как работает ПЦР-тест

Какие бывают тесты ПЦР? Полимеразная цепная реакция — это чисто лабораторный тест. Экспресс-тестов, основанных на ней, не бывает — ведь в момент, когда ДНК «достраивается», смесь нужно нагревать. А для того чтобы «прочитать» результат, требуется дорогостоящее оборудование.

ПЦР-ОТ — очень чувствительный тест, который способен определять даже очень небольшое количество вируса в крови. Причем достаточно рано: так как при анализе не нужно ждать появления в крови антител и вирусных белков, он «сработает» уже через несколько дней или недель после контакта с ВИЧ.

Но тест этот очень дорогой и сложный. Впрочем, это не единственная причина, по которой его не используют для определения ВИЧ-статуса для всех, хотя и это можно сделать в частной лаборатории за деньги. Дело в том, что тест подходит для определения только одного типа вируса — ВИЧ-1. ВИЧ-2 он не находит. Поэтому анализы ПЦР на ВИЧ обычно используют только для контроля лечения человека, который уже знает свой ВИЧ-статус.

Подписывайтесь на канал  СПИД.ЦЕНТРа  в Яндекс.Дзене
Google Chrome Firefox Opera